Il newyorkese Larry Daley, divorziato, ha spesso cambiato lavoro e casa, deludendo il figlio di 10 anni, Nick, che si vergogna a presentare la sua professione a scuola. Finalmente trova lavoro al Museo di storia naturale di New York, il cui direttore, spinto da una sempre minore affluenza, ha deciso di assumere un unico custode in sostituzione dei tre vecchi guardiani: Cecil, Gus e Reginald. Costoro forniscono a Larry un elenco di istruzioni da seguire durante la notte, raccomandandogli di non far entrare o uscire nulla e nessuno dal museo.
Quella sera, dopo una breve pennichella, Larry si accorge che lo scheletro del Tyrannosaurus rex si è mosso dal suo piedistallo, per andare a bere alla fontanella. Spaventato, Larry si rende conto che qualsiasi cosa all’interno del museo ha preso vita. Una delle opere esposte, la statua di cera di Teddy Roosevelt, gli spiega che la magia è causata dal potere della tavola del faraone Ahkmenrah, in oro massiccio, che ha il potere di riportare in vita tutte le opere esposte nel museo. La mummia del faraone è custodita nel museo, vicino alla sua tavola, ma non gli viene concesso di uscire dal sarcofago probabilmente perché considerato violento dagli altri. Nulla, tuttavia, deve uscire dal museo dopo l’alba, pena la trasformazione in cenere. Per la prima notte, Teddy Roosevelt aiuta Larry, che il giorno dopo se la prende con i vecchi guardiani che non gli hanno menzionato nulla, per poi impegnarsi a imparare la storia dei vari personaggi per trarne vantaggio e calmarne gli animi. In questo viene aiutato da Rebecca, guida del museo.